样品分离技巧（针对Brix系列的中压制备）

样品分离技巧（针对Brix系列的中压制备）

上样

常用的上样方式有湿法上样和干法上样两种：

1、湿法上样一般用淋洗剂溶解样品， 也可以用二氯甲烷、 乙酸乙酯等， 但溶剂越少越好。再用注射器将得到的溶液注射到色谱柱顶端。

注意事项：

尽量使用最高的样品浓度，最小的样品体积。当上样体积增大时，样品在色谱柱当中所占用的体积会增大，扩散效应也会明显增强，导致色带变宽，降低分离效率，纯度也随之降低，因此在上样时，应保证最小的体积

尽量使用最接近于起始流动相极性的溶剂溶解样品，如果极性过大，样品还没有来得及和固定相相互作用，就已经被极性溶剂洗脱下色谱柱，导致保留时间不够，洗脱不充分，分离效率大大降低，从而结果不如预期

2、干法上样是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶， 拌匀后再旋去溶剂。一般样品和硅胶按 1：1 （1-2倍）的量混合， 硅胶使用的量也可以少一些， 但是要保证在旋干后， 不能看到明显的固体颗粒，让样品都吸附在硅胶的表面上。

注意事项：

两种上样方式各有优点，湿法上样简单快捷，而干上样虽然步骤繁琐，但有效规避了湿法上样所要注意的一些事项

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洗脱剂的选取

洗脱剂的极性可用薄层层析来确定，一般以待分离样品Rf 值为0.2-0.3为宜。不要认为在板上爬得高分离的效果就比较好，如果 Rf 在 0.6，即使相差 0.2 也不容易在柱子上分开，因为柱子是一个多次爬板的过程。

有时虽然在薄层板上看到分离的效果很好，但过柱层析时还是很难分开。这主要的原因就是薄层层析用硅胶比柱层析用硅胶要细得多，所以分离效果好。

通常解决的办法就是降低洗脱剂的极性，一般柱层析用洗脱剂比薄层层析用的展开剂极性要再降低一倍可以达到比较好的分离效果。当所分离物质极性跨度较大时， 可用采梯度洗脱的方法， 即逐渐增加溶剂的极性，使吸附在硅胶上的不同化合物逐个洗脱下来。

常用的展开剂极性小的用乙酸乙酯、石油醚系统；极性较大的用甲醇、二氯甲烷系统；极性大的用甲醇、水、正丁醇、醋酸系统；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸。对于很难分离的化合物，一是增加柱子的长度和直径，二是减小洗脱剂的极性，这样可以很好地将混合物分开。（增强化合物在色谱柱上的保留，尽量多次的分配）

在同样能洗脱的情况下，尽量使用毒性小的洗脱剂。例如，乙酸乙酯、石油醚系统和二氯甲烷、石油醚系统， 在同样都能洗脱的情况下，应该用毒性小的乙酸乙酯、石油醚系统。

中压制备柱规格与上样量的关系